[关键词]生物 细胞分析
高中生物教材（人教版）在第六章细胞的生命历程中，对细胞增殖过程中染色体（质）行为变化做了详细的分析，同时也是考试的重点。然而大部分教师对细胞分化、细胞衰老、细胞凋亡及细胞癌变过程中染色体（质）的行为变化却知之甚少。笔者在阅读了相关书籍之后，对上述问题做如下总结。
1.细胞分化与染色体（质）行为变化的关系
细胞分化的实质是组织特异性基因（奢侈基因 luxurygenes ）在时间和空间上的差异表达（differential gene express）。这种差异表达不仅涉及基因转录水平和转录后加工水平上的精确调控，而且涉及染色体（质）修饰等复杂的调控过程。这里的染色体（质）修饰主要是指DNA的甲基化。DNA甲基化（DNA methylation）是在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶，这常见于基因的5'-CG-3'序列。甲基化位点可随着DNA的复制而遗传，因为DNA复制后，甲基化酶可以将新合成的未甲基化的位点进行甲基化。DNA甲基化可以引起基因的失活，从而使细胞不需要表达的基因不表达，进而达到差异表达（选择性表达）的目的。如下图
2.细胞衰老与染色体（质）行为变化的关系
染色质固缩化是衰老细胞核中另一个重要变化。体外培养的细胞中，晚代细胞的核中可看到明显的染色质固缩化，而早代细胞的核只有轻微的固缩作用。除了培养细胞外，体内细胞，如老年果蝇的细胞等，都可以观察到染色质的固缩化。染色质固缩与染色质蛋白的二硫键数量有关。
3.细胞凋亡与染色体（质）行为变化的关系
细胞凋亡细胞的核DNA在核小体连接处断裂成核小体片段，并向核膜下或中央异染色质区凝聚形成浓缩的染色质块。随着染色质不断凝聚，核纤层断裂消失，核膜在核孔处断裂形成核碎片。凋亡细胞的核经核碎裂形成染色质块（核碎片），然后整个细胞通过发芽、起泡等方式形成一些球形的突起，并在基部绞断而脱落产生大小不等内含胞质、细胞器及核碎片的凋亡小体；或通过分隔机制形成凋亡小体。总言之，细胞凋亡最突出的生化特征是染色质DNA的有控裂解，并且是由于内源性内切核酸酶基因的活化和表达而造成的结果。这种由内源性内切核酸酶切割的染色质DN段大小是有规律的，即都为200bp的倍数。如下图
〖JZ〗〖HZ（〗〖XC王丽英1.TIF〗〖HZ）〗
1.1细胞活力测定
采用Trypanblue拒染试验检测冻存前及复苏后细胞的存活率。将待检细胞制成细胞悬液，取细胞悬液与04％台盼蓝溶液以9∶1混合均匀（使台盼蓝溶液终浓度为004％），3min后观察，并用血球计数板计数。镜下观察可见健康活细胞胞体完整、细胞透明、不着色，凡着色呈蓝色者均为死细胞。计数1000个细胞，计算细胞活率。
1.2生长曲线绘制
向24孔培养板每孔内接种1mL密度约为1×104个／mL细胞，从接种之日算起，每隔24h计数2个孔内的细胞密度，算出平均值，连续测定12d，以培养时间为横坐标，以细胞密度为纵坐标，绘制细胞生长曲线。
1.3细胞染色体分析
选取第4代生长良好的新生昆明犬成纤维细胞，按照常规方法［9］进行染色体制片，Gimesa染色后选择染色体分散与形态良好的分裂相在油镜下观察拍照，作核型图，对50～100个分裂中期细胞进行染色体数目统计。
2结果与分析
2.1细胞的形态学观察
新生昆明犬耳缘皮肤组织经胶原酶分离培养3～4d后，镜下观察可见有少数细胞沿组织块边缘慢慢贴壁伸展，细胞形状不规则，且其组织块的生长晕形成时间较长。经8～10d培养才出现大量成片生长的优势细胞，此时观察细胞的形态呈长梭形、多角形或扁平星形，为典型的成纤维细胞形态。后再经3～4d细胞生长至汇合，并长满整个细胞培养瓶表面（图1A），此时可进行传代和冻存。传代后的细胞生长旺盛，在形态上与原代细胞无明显差异，经2～3d即可长至近100％汇合，此时细胞呈放射状或涡旋状走势（图1B）。待传代时，加入消化液后显微镜下可见细胞回缩，呈圆形（图1C）。
2.2成纤维细胞冻存前和复苏后的活
耳部成纤维细胞冻存前和复苏后的活率分别为933％，908％（图2）。冻存前与复苏后的细胞存活率差异不显著（P＞005），说明原代细胞和传代细胞生长状态良好，培养条件适宜，且冻存和复苏的过程对细胞活力状况损害较小。
2.3生长曲线
根据昆明犬耳部成纤维细胞接种于24孔板连续培养12d的细胞计数情况，绘制出了成纤维细胞的生长曲线（图3）。昆明犬耳部成纤维细胞的生长曲线呈典型的“S”形，即经过了潜伏生长期、对数生长期、平台期以及衰亡期。其表现为1～2d的潜伏生长期细胞总数基本保持不变，从第3天起，细胞数量开始增加，3～8d左右细胞明显地进入对数生长期，细胞数量快速增长，第8～9天，细胞由于缺乏足够生长空间而增长放缓，开始进入平台期。第9天后，由于细胞数量的急剧增加、生长空间的极大限制，经过短暂的平台期后，细胞发生接触抑制快速进入衰亡期，细胞生长几乎停止，随后细胞逐渐脱落死亡，此时镜下可见有大量凋亡细胞漂浮。由生长曲线上的数据分析，耳部成纤维细胞群体倍增时间约为32h。
2.4核型观察分析
昆明犬耳部成纤维细胞中期染色体分裂相与核型分析如图4所示：染色体数目2n＝78（XX）。计数80个4代细胞的染色体数目，总数2n＝78的细胞数约占总细胞数的90％，达到了建立细胞系75％～80％的要求，说明所建细胞系为稳定的二倍体细胞系。39对染色体中有38对常染色体均为端着丝粒（T）染色体，长度逐渐递减；性染色体X，Y均为中央着丝粒（M），X染色体的长度最大。
3讨论
目前，国内已有一些研究报道建立了比格犬胎儿成纤维细胞系［10］、德国牧羊犬耳部和腹部成纤维细胞系［11］及杂交犬皮肤成纤维细胞系［12］等，但利用犬类的这些细胞遗传资源进行更加广泛深入的研究（如医疗和动物模型的建立、体细胞克隆等）还十分欠缺。在国外，已有较多使用所建立的犬胎儿或成体成纤维细胞系进行体细胞核移植（SCNT）的研究［13－16］。值得注意的是，在警用工作犬领域，7头世界首批体细胞克隆警犬于2007年底在韩国诞生［17］，2009年韩国克隆专家根据美国911英雄警犬“特拉克”的遗传信息，再次利用体细胞克隆技术成功获得了5头牧羊犬（http：／／wwwcnwnewscom／html／tech／cnkpzs／20090621／122171html）。LEE等［18］将曾服役于韩国国家紧急事务管理署（NEMA）具有6年全球救援经验的退役搜救犬进行克隆，最终获得2头克隆犬。这些克隆后代中大多数工作犬已服役并具备与父辈同样卓越的工作性能。同时，OH等［19］的研究也表明，利用SCNT技术将能使一头优秀的检验检疫犬复制出一群同样优秀的检验检疫犬。体细胞克隆技术最大的优势在于克隆出生的动物与供体细胞来源的动物具有几乎100％相同的基因，即能完全保持亲代优异的先天特质。要成为一只优秀的警犬，就必须要具备高智商、敏锐的嗅觉、良好的亲和能力等警犬所必备的各种特质。按照传统的警犬繁育方式，培育出一头优秀警犬至少需要3～4年时间，花费约10万元，期间要消耗大量的人力、物力和时间，且培训的优秀率低，不超过12％；而要培养出一头功勋级的警犬需要付出的代价就更大，最少需数10人，4～5年时间，约50万元的费用，且培养出一头功勋级警犬的效率很低，约8‰。而动物体细胞克隆技术可以批量复制优秀、功勋级的警犬，可以大大降低培育成本，提高培养功勋警犬的培育效率。因此，体细胞核移植技术在警犬繁育中具有广阔的应用前景。然而，体细胞核移植技术首先必须要解决的是供体细胞的来源和体细胞分离培养的问题。本研究利用胶原酶消化法建立了新生昆明犬耳部成纤维细胞系，并对其体外培养的生物学特性也进行了初步的分析与探讨。在动物成纤维细胞的体外分离培养中，分离组织可以取自胎儿、新生幼仔及成体动物［20－22］。其中，胎儿取材不仅难度大、成本高，且对优良品种的保存也十分不利。相反地，新生幼仔或成体动物耳部、腹部及腹股沟等部位皮肤组织的取材则显得十分便捷，且不影响动物的健康成长。本试验取材自新生昆明犬耳缘皮肤组织（＜1cm2），对于新生仔犬，其伤口愈合快、皮肤组织修复能力强，应激性小且容易护理。另外，新生幼犬较成犬组织分化程度低，其成纤维细胞理论上应具有较强的增殖能力、易培养及适于进行相关基因操作研究。本试验所建立的新生昆明犬耳部成纤维细胞具有典型的成纤维细胞形态，如细胞呈梭形或星形，当生长至汇合时细胞会平行排列，呈涡旋状和放射状生长。其冻存前和复苏后存活率差异不显著（P＞005），细胞复苏后增殖快、生命力旺盛，且形态未发生变化。这表明冻存和复苏过程中的各项条件对细胞活力影响较小，试验中采用的冻存和复苏的方法是可行的。
【关键词】红细胞 生物教学
红细胞又称红血球或红血细胞，是血液中最多的一种血细胞。红细胞分为两类，一是哺乳动物的红细胞；另一类是非哺乳动物（鸟类、两栖类、鱼类）的红细胞。下面着重介绍与这两个方面相关的知识内容。
1.哺乳动物的红细胞
1.1 基因突变的实例。正常人的红细胞呈双凹圆饼状，中央较薄，周缘较厚，而镰刀型细胞贫血症患者的红细胞却是弯曲的镰刀状，这种细胞形状上的改变用光学显微镜是可以观察到。究其原因，镰刀型细胞贫血症属于基因突变的结果。而基因突变是染色体的某一位点上基因的改变，这种改变在光学显微镜下是无法直接观察到的。所以讲到基因突变就经常提及镰刀型细胞贫血症。
1.2 制备细胞膜。哺乳动物成熟的红细胞，它没有细胞核和众多的具膜细胞器，即除细胞膜外无其他的膜结构，因此可以获得较纯净的细胞膜，加之取材方便。故在 “体验制备细胞膜的方法” 实验中，被认为是最理想的材料。
1.3 研究动物细胞的吸水和失水。正常状态下红细胞内的渗透压与血浆渗透压大致相等，这对保持红细胞的形态甚为重要。加之动物细胞没有细胞壁，将红细胞置于等渗溶液（NaCl/0.9%）中，它能保持正常的大小和形态；将红细胞放在低渗溶液中，水分将进入细胞，红细胞容易吸水膨胀变成球形，可至膨胀而破裂；相反，将红细胞放在高浓度溶液中，水分将逸出细胞外，红细胞将因失水而皱缩。这些变化在光学显微镜都很容易观察到。所以，它又是研究“动物细胞的吸水和失水”的好材料。
1.4 真核细胞并非都有细胞核。真核细胞与原核细胞的区别就是前者有真正的细胞核，但并不是所有的真核细胞都有细胞核。如哺乳动物成熟的红细胞就无核，这样一来，就成了除哺乳动物成熟的红细胞等少数细胞以外，真核细胞都有细胞核。
1.5 细胞只有保持完整性才能完成各项生命活动。哺乳动物成熟的红细胞无核，所以一般不能存活多久，即寿命都很短。红细胞与健康红细胞平均寿命为120天，每天都有一定数量的红细胞进行更新。原因是细胞的各个部分不是彼此孤立的，而是互相紧密联系、协调一致的，细胞只有保持完整性，才能够正常地完成各项生命活动。这也有力地说明细胞完整性的重要意义。
1.6 体细胞并非都存在等位基因。哺乳动物成熟的红细胞无核，故不含DNA（DNA主要存在细胞核中），进而也不存在染色体，当然也就不存在等位基因。
1.7 故衰老的红细胞没有核体积变化。衰老的细胞，细胞核的体积增大，核膜内折，染色质收缩、染色加深。哺乳动物成熟的红细胞无核，故衰老的红细胞没有核体积变化这个特征。
1.8 人体的细胞并非都进行有氧呼吸的。哺乳动物成熟的红细胞中没有线粒体，也就是说没有有氧呼吸的场所，所以只能进行无氧呼吸。这也说明人体的细胞并不都是进行有氧呼吸的。
1.9 红细胞跨膜运输的方式。哺乳动物成熟红细胞内无线粒体，通过无氧呼吸释放能量，因能量的利用效率较低，所以葡萄糖进入红细胞为协助扩散；而其他细胞有线粒体能进行有氧呼吸，能量的利用效率较高，故葡萄糖进入其他细胞则为主动运输。
1.10 提取血红蛋白。血液由血浆和各种血细胞组成，其中红细胞最多。在红细胞的组成中，除水分以为，约90%是血红蛋白。故用哺乳动物成熟的红细胞提取血红蛋白。
1.11 血红蛋白和血浆蛋白。红细胞的主要功能是运输O2和CO2，此外还在酸碱平衡中起一定的缓冲作用。这两项功能都是通过红细胞中的血红蛋白来实现的。如果红细胞破裂，血红蛋白释放出来，溶解于血浆中，即丧失上述功能。血红蛋白是红细胞内部的成分，不在细胞外液（相对人体外部环境来说，又称为内环境），即血红蛋白不属于人体内环境组成成分；血浆是血细胞直接生活的环境，血浆中的蛋白质称血浆蛋白，它属于人体内环境组成成分。
2.非哺乳动物的红细胞
2.1 无丝分裂。无丝分裂是最早发现的一种细胞的分裂方式，早在1841年就在鸡胚的的血细胞中看到了。因为在分裂开过程中核膜、核仁不消失，无染色体和纺锤丝的变化，所以叫无丝分裂，它是真核细胞的一种分裂方式，如蛙的红细胞分裂方式就是这样。
2.2 提取DNA。非哺乳动物的红细胞仍然有核，含DNA。对鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分子可以大量进入血细胞，使血细胞胀裂，同时用玻璃棒搅拌，就加速了鸡血细胞的破裂，从而释放DNA，过滤后收取滤液即可。
[中图分类号] R197 [文献标识码]B [文章编号] 1005-0515（2010）-12-205-01
血液标本是检验科最常见的标本之一。在血细胞分析过程中，血液中可能存在的细菌、病毒、真菌及寄生虫等病原体对实验室环境及操作人员而言是潜在的危害。本文就血液实验室潜在的生物安全危害及安全防护措施报告如下。
1 检验人员基本安全防护
检验人员应提高生物安全防范意识，进入实验室污染区后要穿工作服及专用鞋。血液标本中可能存在各种病原体，检验人员在接触标本的过程中应戴手套，且戴手套后不应再接触清洁表面。当手套破损后，手被血液污染时应立即洗手。在进行可能产生气溶胶的操作时，需进行头面部保护，如戴口罩、眼罩或帽子等。不应在实验室中穿露趾鞋。应定期对检验人员体检，建立检验人员的健康档案。工作结束要离开实验室时，使用的防护用品应先消毒，后摘除，脱去手套后须洗手。实验操作完毕后应按“六步法”正确洗手。工作服由医院统一清洗，不可带回家。检验人员不应在工作区内饮水、吃东西、吸烟、化妆、处理隐形眼镜等，不得在工作区存放私人物品，未得到批准不得在工作区内接待外来客人。
2血液标本采集及运送中的安全防护
血细胞分析标本分为静脉血及末梢血两种。静脉血采集实施一人、一针、一管、一巾、一带，条件允许的情况下，应使用与仪器匹配的一次性安全真空采血管以取代传统的针头和注射器，这样既保证了血液标本检测质量又保证了工作人员采血及操作时的生物安全。末梢血采集应做到一人、一针、一管、一片，对每位患者操作前后要认真进行手消毒。从患者身上拔出针头及真空采血管与针头分离时，要防止被针头刺伤，不要给用过的注射器针头戴护套。使用后的一次性针头、玻片应存放在耐刺、防渗漏的锐器盒内，当达到容量的3/4时就予以更换。末梢血采集时要避免血液直接接触皮肤，如手不慎接触到血液要立即洗手。采血时，可能会发生被针头刺伤的情况，存在感染乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒（HCV）、人类免疫缺陷病毒（HIV）的可能。针刺伤后是否发生感染取决于暴露时间、伤口深度、携带病毒的血量、是否接种疫苗等。血源性HBV的职业暴露最常见，而乙肝预苗的接种可减少HBV感染的风险,因此建议检验人员接种乙肝预苗，预防HBV感染[1]。标本运送应采用密闭容器盒，以确保工作人员及环境不被污染。
3 血细胞分析检测过程中的安全防护
近年来，各类血细胞分析仪的普遍使用，静脉血血细胞分析大都为全自动检测，一般无需将采血管盖子打开，加样针能直接插入采血管吸到标本，整个分析过程构成了一个封闭系统，避免了检测过程中的污染问题。血细胞分析过程中，采血管的开启、加样、振荡均能产生大量气溶胶，而全自动血细胞分析仪可以避免气溶胶扩散。气溶胶是悬浮于气体介质中固体、液体微小粒子形成的胶溶状态分散体系。气溶胶无色无味、不易发现，检验人员可在自然呼吸中不知不觉吸入而造成感染。静脉血细胞分析有时也需要手动操作，需将采血管盖子打开，此分析过程不能构成封闭系统，故不可避免的产生气溶胶，因此手动操作时建议戴口罩，可有效防止气溶胶吸入体内。多数医院的检验科，末梢血血细胞分析是手动操作加样的，开盖及混匀要轻，避免产生过多气溶胶。打开采血管时，可以用纸或纱布抓住盖子以防止喷溅。实验完成后要立即盖上采血管盖，这可以减少气溶胶的产生。手动加样时由于血液容易喷溅，建议戴口罩以防止气溶胶吸入体内。实验过程中如有血液溢出，应立即用布或纸巾覆盖，然后在上面倾倒5g/L含氯消毒剂，作用30分钟后将布或纸巾清理掉，再用1g/L含氯消毒剂擦拭污染区。实验过程中意外出现扎伤、皮肤污染血标本时，应立即用肥皂水清洗，再用大量流水冲洗伤口。根据锐器污染源的不同可采取相应的预防措施，并进行血源性传染病的检查和随访。黏膜、结膜被污染后应用大量的水冲洗。实验过程中还要防止间接传播，接触样品的手污染了操作台、仪器、物品等，都可能造成间接传播。每日工作结束后用1g/L含氯消毒剂全面擦拭消毒，每日下班后开启紫外灯对空气消毒，照射时间一般应大于30分钟。
4 血细胞分析废弃物的正确处理
实验完毕后，标本用塑料膜封好，分类放入冰箱保存。保存期满的标本存放在双层无渗透、无破损的黄色医疗废物包装袋中，当达到3/4时，封好袋口由专人签收送到废弃物放置点，统一焚烧。盛放锐器的一次性容器，应将其放入“感染性废弃物”的容器中进行焚烧,焚烧温度应高于800℃，如低于800℃就会产生二恶英、呋喃等有毒物质。用过的废液要经过处理达到无害标准后才能排放。对一次性医院废物应先消毒，再集中收回进行毁形处理。
由于工作性质特殊，血液实验室是一个与血液密切接触的地方，而血液中可能存在各种病原微生物。如检验人员缺乏生物安全意识，不加强安全防护，违规操作，可能会造成生物危害。只要检验人员能重视生物安全防护工作，对潜在的生物危害有充分认识，遵守操作规程，一定能将生物安全工作推上新的台阶。
关键词：实践；细胞生物学；教学效果
中图分类号：G642.0 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2013）46-0176-02
任何知识的学习都以学以致用为最终目的，必须做到理论联系实际，细胞生物学的学习也是如此，而且生物这门学科本身具有较强的实践性，我国在进行生物学教学的时候，也是将实验教学放在首要位置的，但是，我国基于实践的细胞生物学教学体系并不完善，需要对教学方法进行深入的改进，使细胞生物学的知识能在实践研究中得到更好的应用。
一、将细胞生物学教学与实践结合的重要意义
1.将细胞生物学教学与实践结合起来是学科本身发展的需求。细胞生物学是一门基础性的生命科学，主要任务是研究细胞的生命活动规律，通过对细胞生命现象的观察，总结出细胞生命活动的规律，进而采用合理的方法手段控制或者引导细胞向有利于人们身心健康的方向发展，近些年，全球癌症的发病率逐年上升，鉴于这种实际现状，世界上的细胞生物学开始尝试通过一定的物理或者化学手段，减少癌症的发病率、增强癌症患者的生命期，并且已经取得了良好的研究成果，所以，生物学本身的发展就要求理论与实践相结合。
2.将细胞生物学教学与实践结合起来是人才培养的需要。目前，根据我国生物科学的发展现状，生物学方面的学生就业方向主要是地方教育机构或者一些生物方向的厂家。对于地方教育机构来讲，随着我国教育事业的不断发展，现在的生物学教育理念已经发生了巨大的变化，现在的教育模式更倾向于课堂实验教学，老师通过课堂做实验，让学生对自己得出结论。
3.将细胞生物学教学与实践结合起来是提高教学质量的需求。细胞生物学的实践教学可以提高学生对事物的观察能力和操作能力，对未来的生物数据处理和实际应用生物理论解决问题能力也有很大的帮助，在进行有效的生物教学之前，学校必须首先为实践教学创造良好的硬件条件，购买一些先进的生物设备、根据实际需要建立具有一定规模的实习基地，社会对学生细胞生物学的检验标准不仅仅是依靠学习成绩，更多的是考查学生对实验内容、实验操作细节等的理解程度。实践是学好细胞生物学课程的基础，将细胞生物教学与实践结合起来对提高教学质量有很好的效果。
二、提高基于实践的细胞生物学教学效果的措施
我国的细胞生物学实践教学主要方式是课堂的实验教学，所以，要想提高基于实践的细胞生物学教学效果还得从提高实验教学效率入手，通过提高学生做实验的学习效率来达到提高生物屑教学效果的目的。
1.改变实验教学模式。以前我国的学校进行细胞生物学实验的方法是：老师将实验步骤、实验操作、注意事项在实验之前全部告诉学生，学生在老师设置的要求里用心完成课堂实验，造成学生在做实验的时候，对老师的指导形成了严重的依赖性，缺乏创新意识，不利于学生未来实践能力的培养。鉴于这种情况，我国开始改变实验教学模式，在保证学生生命安全的条件下，尽可能的将实验变成开放性实验，增强学生在实验过程中的自主性，学生根据自己的设想，用一定的实验方法去验证自己设想的可行性，老师的任务是现场监督实验的安全性，对一些存在安全隐患的实验方法进行制止，并在实验快要结束的时候，将课本上的实验方法进行讲解，并鼓励学生无论设想是否正确都要积极去做，科学的路上本来就充满挫折，失败是很正常的，使学生更加愿意按照自己的设想去做实验，久而久之增强了学生的实验设计能力和创新能力，从长远来看必将推动我国甚至世界生物科学的发展。
2.及时的更换实验内容。科学技术在不断的进步，生物科学也不例外。在生物学实践教学的路上必须不断丰富实验内容，及时的让学生学习到世界先进的研究成果或者优良的研究方法。学校可以根据本校学生的实际情况，适当增加实验的难度，在安排实验的时候尽量多一些创新性的实验减少验证性实验的比例，因为相对应于验证性实验，创新性的实验更加有利于培养学生的创新能力和生物研发能力，创新性实验提前不知道实验结果，学生带着问题和好奇去做实验，而验证性实验学生在做实验之前就已经知道了本实验的实验结果，只是通过一定的方法验证结论即可，此外创新性实验的实验结果不唯一，有利于培养学生的发散思维，根据自己对实验现象的不同理解，从不同的角度得出不同的实验结论。实验是一个实践性的教学，更改实验内容光从改变这些实验的理论是不够的，还必须要求实验硬件的配合，增加在实验方面的投资，购买一些先进的实验设备，聘请一些国内外知名的生物学教授来学校进行教师的培训或者办学生讲座，软件和硬件双管齐下才能达到更换实验内容目标，最终提高基于实践的细胞生物学教学效果。
3.老师根据学校现有的物质条件，合理的安排实验内容。虽然我们在细胞生物学的教学过程中，大力支持和发扬实践教学，也就是将课堂做生物实验作为教学的主要形式，学生通过做实验，将理论与实践结合起来，并从中锻炼自己实际解决问题的能力，甚至创造出一些科技成果来，但是，我们也不能盲目的追求实验教学，因为大多数实验尤其是生物实验需要非常先进的设备，有的还需要珍贵的材料做实验标本，这会无形之中提高学校的教学成本，不利于学校的可持续发展，所以，必须将实践教学与学校的实际办学条件紧密结合起来，老师根据目前学校目前拥有的先进设备和实验标本合理的安排实验，保证将现有的资源合理利用，对于那些必须的先进生物设备和实验标本老师应该向上级部门提出申请，希望学校能尽力满足。当学校的实际条件不允许的时候，老师不能将实验内容省略，而是可以对实验的实际环境和场景进行模拟，让学生尽可能的感受实验的过程，虽然模拟环境与实践环境有一定的差异，但是对学生未来的实践却有着不可忽视的作用。此外，提高生物学实践教学效果的方法还要求老师根据本校实际情况自编实验教材、在实验结束后开展实验讨论会、完善细胞生物学实验的考核制度等等。
理论联系实践是当代教育改革的一个重要任务，细胞生物学的教育也是如此，必须将生物知识通过具体的实验与实践联系，才能让学生真正的理解知识的内涵，增加对知识的理解深度，并积累丰厚的实践经验，为以后的实际工作打下坚实的基础。本文通过介绍细胞生物学实践教学的重要性，从如何提高课堂实验教学效率方面入手，对基于实践的细胞生物学教学做简要分析。
参考文献：
[1]樊廷俊，初建松，细胞生物学课程教学改革与教书育人的初步尝试[J].中国大学教育报，2003，（05）：25-25.
[2]闻亮，加强实践教学，注重学生创新精神和实践能力的培养[J].内蒙古师范大学学报，2009，（02）：46-48.
[关键词] 肝细胞癌；血清；代谢物组；LC-MS；主成分分析；模式识别
[中图分类号] R735.7 [文献标识码] C[文章编号] 1674-4721（2011）06（a）-085-02
目前，临床上诊断肝癌的主要方法为病理、影像和血清AFP检查。这些检测手段中，病理法属于有创性检查，对患者造成组织损伤，不能作为常规检查方法；B超、CT、磁共振成像对小肝癌灶检出率较低；血清AFP检查诊断肝癌灵敏度低，因此，建立一种无损、准确、灵敏的肝癌诊断方法具有重要的临床价值。代谢组学是一种通过考察生物体系受刺激或扰动后代谢产物随时间的变化，并以此来研究生物体系代谢途径的新技术[1-2]。代谢组学作为新兴的学科，已成功应用于疾病诊断、药物作用模型的鉴别和确证、药物作用机制研究等领域[3-6]。目前代谢组学分析中常用的两种检测手段是核磁共振（NMR）技术和质谱（MS）及其联用技术。相比于NMR灵敏度低、检测动态范围窄等弱点，现代MS技术的优势是具有很高的灵敏度和专属性，可以实现对多个化合物的同时快速分析与鉴定，现已成为生物分析中的首选方法。本研究采用LC-MS法检测肝癌患者和健康人血清中代谢物，比较分析两组血清代谢物组的差异，同时利用PCA对MS数据进行模式识别，以期建立肝癌的诊断模型。
1 仪器与试剂
1.1 仪器
Agilent 1100型高效液相色谱仪，Agilent LC/MSD Trap XCT Plus 型质谱仪、高压二元梯度泵、二极管检测器、自动进样器、柱温箱、Chemstations化学工作站等（美国Agilent公司），日立20PR-52D型高速冷冻离心机，电热真空干燥箱（上海申光仪器仪表有限公司），KQ- 250 DE型数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司），Milli-Q纯化水制备系统(Millipore公司)。甲醇、乙腈均为色谱纯（美国fisher公司）。
1.2 样品的采集
分别采集30份男性肝癌患者以及30份健康男性 （无相关病史的健康人群)受试者静脉血5 ml 至促凝管中，室温下静置1 h后在4℃、13 000 g离心10 min），置-80℃贮存备用。采血前禁食12 h。肝癌诊断标准按照2001年中国抗癌协会肝癌专业委员会修订的肝癌临床诊断标准[8]，上清液LC-MSn分析。
1.3 LC-MS 条件
反向液相色谱（RP-LC），色谱柱：Prevail C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流动相A：10mM甲酸铵缓冲液（甲酸调PH 4.0）；B：0.1%甲酸乙腈，A与B梯度洗脱：0～5 min，B%10～30，5～9 min，B% 30～60，9～20 min，B%60～70，20～25 min，B%70～100；柱温：25°C；流速：0.8 ml/min；质谱条件：ESI离子源，离子源温度350℃，毛细管电压3.5 kV，雾化压力285.8 kPa，雾化压力60.0 Psi，干燥气流速11.0 L/min，质谱扫描范围75～800 m/z，正离子检出模式。
2 结果
2.1 血清样品检测总离子流图
按照以上实验方法，对血清样本进行了分析测定，图1中A、B分别是健康人和肝癌患者血清典型的LC-MS总离子流谱，图中可见，正常人血清样本的总离子流图与肝癌患者血清样本的总离子流图有明显区别。
A为健康人血清；B为肝癌患者血清
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2.2 肝癌的生物标记物
通过LC-MS检测，与正常人相比，肝癌患者血清中牛磺酸和组氨酸含量减少，而苯丙氨酸、酪氨酸含量增加。牛磺酸是重要的抗氧化物质，曾有研究报道，其在肝硬化患者血清中含量增加，而肝癌患者血清中牛磺酸含量没有改变[7]，但笔者研究发现牛磺酸在肝癌患者血清中含量减少，推测牛磺酸的含量与肝癌病情程度有关，需要进一步研究。
2.3 模式识别分析
利用PCA对正常人和肝癌患者两组血清LC-MS数据进行模式识别分析，得到相应血清标本的PCA得分图（3D PCA Scores plot)。得分图中每一个点代表了一个标本，见图2。从图2中可以直观地看出各血清标本在空间上的位置以及相互聚合程度，图2中肝癌和健康人标本显著分离，说明两者血清代谢物组确实存在显著差异。
3 讨论
为了探讨利用代谢组学技术结合模式识别分析诊断肝癌的可行性，对肝癌患者血清LC-MS数据进行PCA分析。结果表明肝癌患者可与健康人标本100%区分开来，利用基于LC-MS代谢组学技术结合PCA的模式识别方法诊断肝癌诊断结果可靠。有利于临床早期诊断、早期治疗肝癌。此外，由于代谢组学反应的是基因和蛋白表达终端的变化、是对基因组学和蛋白组学在代谢物研究上的放大，因此利用此技术诊断疾病更灵敏、快速。
[参考文献]
[1]罗和古，丁杰，岳广欣，等.大鼠肝郁脾虚证的代谢组学研究[J].中西医结合学报，2007，5(3):307-313.
[2]Jeffrey R，Idle1，Frank J，Gonzalez．Metabolomics[J].Cell Metabolism，2007， 12(6):348-350.
[3]Clayton，T.A，Lindon，J.C，Cloarec，O，et al.Pharmacometabonomic phenotyping and personalized drug treatment[J].Nature，2006，440(7087):1073-1077.
[4]黄成钢.中药研究的必然趋势—中药复方系统研究[J].中国药学杂志，2000，35(7):4331.
[5]周宏伟，谭凤仪，钟音，等.代谢组学及其在微生物领域的研究进展[J].分析化学，2007，35(2):309-314.
新课标和新教材最突出特点是以学生发展为中心,体现学生主体地位,面向全体学生,注重学生思维能力和学习方式的培养,倡导探究性学习和注重与现实生活的联系。所以在课堂教学设计中笔者采用以学生发展为本的主体性教学模式,从学生的认知水平出发,结合教学内容,精心设计问题,营造探究氛围,使学生在观察、讨论、探究、合作交流中相互启迪、自主学习、构建模型。
二、教学分析
1.教材分析
“物质出入细胞的方式”是浙科版普通高中课程标准实验教科书生物必修1《分子与细胞》的第三章第二节的内容。第二章已经介绍了细胞膜的化学组成和细胞膜的功能,这一节是在此基础上探讨细胞膜控制物质进出的几种方式,在细胞膜的亚显微结构基础之后,带领学生继续探究细胞膜控制物质进出功能的方式和原理。这样的编排符合学生认知规律,有助于帮助学生建立结构与功能相适应的观点。
2.学情分析
通过前几章节的学习,学生对于细胞的分子组成、基本结构和探究的基本步骤已有了一定的认识,能理解细胞膜是系统的边界,并且大部分学生已经对生物有了较浓厚的学习兴趣,很渴望在此基础上进一步探究物质是怎样进出细胞的,有哪些方式等有关细胞功能方面的知识。
3.教学重难点
(1)教学重点:比较物质出入细胞的各种方式的异同。
(2)教学难点:理解渗透作用原理。
三、教学目标
1.知识目标
(1)简述扩散的特点。
(2)阐明渗透的概念及原理。
(3)比较说明红细胞吸水与失水的原因;概述被动转运和主动转运的概念;比较扩散、易化扩散和主动转运。
2.能力目标
(1)学会综合运用比较、分析、归纳、综合等科学思维方法。
(2)设计实验,逐步领悟探究过程的一般方法与基本思想,培养自身的科学探究能力以及语言表达的能力。
(3)通过构建模型和概念图,提高知识建构能力。
3.情感、态度与价值观目标
(1)通过分析扩散和渗透作用的过程,渗透生命活动不断发展变化以及适应的特性,逐步学会自觉地利用发展变化的观点认识生命。
(2)领悟科学探究思想,体验探究活动中的成就感。
(3)通过探讨问题,设计实验,培养合作意识和实事求是地对待实验结果的态度。
四、教学策略与手段
(1)改变过去单纯的教师讲授和学生接受的教学方式,以问题探究教学为主线,教师通过多媒体创设问题情境,引导学生运用讨论法、实验法、学案导学、模型建构等方法开展学习,充分调动学生学习的积极性,发挥学生主体的作用。
(2)课前准备:
①学生预习本节课相关知识,提出相关问题;
②教师针对教学设计准备好相关的多媒体课件、学案,实验所需的材料和用具。
五、教学过程
1.导课
教师组织引导学生思考(多媒体展示不同物质通过不含蛋白质的脂双层):
(1)什么样的分子能够通过脂双层?什么样的分子不能通过?
(2)氨基酸不能通过无蛋白质的脂双层,但是能进出细胞的原因是什么?
学生活动:学生观察,思考问题,根据教师引导总结出不同物质通过细胞膜的几种方式。
教学设计意图:创设问题情境,学生主动参与学习过程,激发学习兴趣。
2.学习扩散
教师组织引导学生亲手实验将墨水滴到烧杯中并观察现象,并引导学生讨论什么是扩散。
学生活动:学生实验,观察实验现象,讨论、交流。
师生共同总结出扩散是分子从高浓度处向低浓度处运动的现象。
教学设计意图:学生实验,吸引学生注意力,体现学生在学习中的主体地位。
3.学习渗透
教师演示实验,实验装置如图1所示。
教师设计问题串:
(1)漏斗的液面为什么上升?
(2)如果用一层纱布代替玻璃纸,液面还会升高吗?
(3)如果烧杯中也是同样浓度的蔗糖溶液,结果会怎么样?
学生在教师的指导下归纳出产生渗透现象两个必要条件以及渗透的方向是从低浓度溶液到高浓度溶液。
教学设计意图:通过观察演示实验,学生经历“现象——问题——分析——结论”,主动构建出渗透作用的条件,提高归纳总结的能力。
教师通过多媒体动画演示微观展示渗透实验。
问题探究:
(1)渗透是水分子跨过膜的扩散。扩散的方向是怎么样的?
(2)那么渗透作用与扩散现象相矛盾吗?
学生活动:思考、回顾前面扩散有关知识,通过相互讨论在教师指导下得出回答渗透是水分子跨过膜的扩散。
教学设计意图:学生在实验的基础上通过多媒体的清晰展示,清楚观察到了微观的渗透现象,使抽象的知识具体化,从而得出渗透的概念,突破难点。
4.学习被动转运
教师通过多媒体动画演示氧和二氧化碳进出细胞的现象。创设问题情境:给出扩散的实验数据,请学生分析数据(表1),构建数学模型,绘出坐标曲线。
学生活动:建构模型绘出曲线(图2)。
教师用多媒体演示展示葡萄糖进入红细胞的现象。创设问题情境:给出葡萄糖跨红细胞膜的实验数据(表2),请学生分析数据,构建数学模型,绘出曲线。
学生活动:建构模型绘出曲线。
教师组织引导学生观察曲线后,评价扩散和易化扩散有何异同点。
学生归纳总结。
教学设计意图:用多媒体演示物质跨膜运输的各种方式,直观形象表现出事物的空间中的关系。学生构建模型,需要进行表格与曲线的相互转换,使抽象的问题直观化、具体化,能够变抽象思维为形象思维,有助于把握问题的本质。
5.学习主动转运
教师组织引导,创设问题情境:
(1)海带中碘的浓度高出海水中碘浓度的200倍,但是海带照样从海水中吸收碘,由低浓度一侧向高浓度一侧运输。
(2)人的红细胞和血浆中的各种离子浓度如下页表3所示。
以上两种情况说明细胞对离子的吸收是从低浓度到高浓度,这种运输方式是主动运输。教师引导学生根据资料中思考主动运输与被动转运相比两者的区别。
学生活动:思考、讨论回答,总结主动转运的特点。
教学设计意图 :创设问题情境,自然引入主动转运,提高学习兴趣。
师生共同小结:设计表格对扩散、易化扩散、主动转运进行比较。
6.课堂反馈
教师组织引导一:实验探究:现有两瓶没有标签的蔗糖溶液,请学生利用所提供的材料(半透膜、漏斗、烧杯、橡皮筋),根据今天学习的知识,设计一种实验方案,比较两瓶溶液浓度的高低,并预期实验结果及得出相应结论。
学生活动:分组讨论、设计实验方案并预期实验结果及结论。
教学设计意图:充分发挥自身自主探究能力,培养自身的实验设计能力,逐步领悟探究过程的一般方法与基本思想,提高语言表达、分析归纳的能力。
教师组织引导二:建构模型:请尝试画图表示随氧气浓度与离子运输速率的关系,并分析曲线各阶段的限制因素。
学生活动:绘制曲线图(图4)。
教学设计意图:通过模型建构复习巩固知识,突出教学难点。
六、问题研讨
1.在教学过程如何进行探究性学习
探究性学习是一种学生学习方式的根本改变,学生由过去主要听从教师讲授、从学科的概念和规律开始学习的方式变为学生通过各种事实来发现概念和规律的方式。本节课通过创设问题情境,积极引导学生自己去探究、去尝试、去分析、去体验,最终获得正确的知识和相应的能力,但教学设计探究的问题收集和提出仍然以教师为主。教师在进行教学设计的时候应充分尊重学生,满足学生的好奇心和探究欲望,形成学生的问题意识,学生应该参与到资料的收集和问题的提出,应鼓励学生多角度地思考问题,确保多种问题的碰撞,最终形成科学的假设。另外学生要积极参与设计实验和实施实验,很多的探究都是通过实验来完成,所以本节课学生不仅亲手演示实验,而且在最后还通过设计实验来解决生活实际问题。
